Ⅰ.目的

　　聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）是近年来极受欢迎的DNA增殖技术，应用层面非常广。PCR原是1984年美国Cetus公司的Kary Millis所发明的一项新技术，它可以在很短的时间内，准确的将某一特定的序列进行量的放大，而使得原先可能才只有几个pg的DNA增加至mg，此时侦测起来就大为容易。PCR技术其实是非常简单而直接，它的原理完全仿照自然界DNA合成的步骤，只是加以自动化而已。基本上，这个技术主要包含三个步骤：DNA分开（denature）、引子炼合（annealing）及引子延伸（extension）。

　　PCR技术可以检定重组质体pT7-lacZ，如果目标lacZ基因片段3.2 kb已被选殖至载体上，可以PCR扩增这段DNA片段，选用适当的核酸引子对夹出目标DNA，理论上一个是T7 primer，此特殊核酸序列仅存于载体pT7-6上，另一个引子CR-gal 是在lac-Z gene上（363~387 nts），而且是反方向（朝向ATG），此特殊核酸仅存于pINDlacZ。当重组质体完成后，lacZ gene 便会在T7 promoter之后被表现，因此，使用核酸引子对T7与CR-gal 不会在pT7-6或pINDlacZ质体上有任何的PCR产物，相反的，唯有重组质体pT7-lacZ方可得到约470 bp的PCR产物，同时印证了重组质体是正确的构筑。

　　本实验乃以pCRT7/CT-LacZ为范本，运用PCR技术来扩增CT-T7与CR-gal primer之间470 bp的lacZ gene产物。

II.Polymerase chain reaction （PCR）

1.仪器用具：

a. PCR 机器

b. 迷你电泳槽及铸胶器

2.药品及试剂：

a. 范本DNA：pCRT7/CT-LacZ （50 ng/ml）

b. 核酸引子对：CR-T7 primer：5′-AAATTAATACGACTCACTATAGGG-3′

　　　　　　　CR-gal primer：5′- ATCGTAACCGTGCATCTGCCAGTTT-3′

　　　　　　　　　　　　　　　　(covering lacZ gene 363-387 nts)

c. 10x PCR buffer：500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl, pH 8.3, 15 mM MgCl₂, 0.1﹪gelatin

d. dNTP （2.5 mM each）

e. Taq DNA polymerase

3.方法步骤：

１）取一支0.2 ml 薄壁PCR管，各加入下列各项：

２）设定PCR反应条件：

Denature：94 ℃ for 1 min

35 cycles：94 ℃ for 1 min, 55 ℃ for 1 min, 72 ℃ for 2 min

Elongation：72 ℃ for 7 min

３）将PCR管子置入反应器中进行反应。

４）取10 ml PCR产物进行电泳分析，观察约470 bp的产物。