I.目的

    DNA/RNA转移到硝化纤维或尼龙膜后，可用放射线性标记过或由可侦测化学基衍生来的探针（probe）DNA/RNA与样品杂合而侦测之。若用³²P或³⁵S标志法，杂合反应后尚需放射线性自动显影术来侦测已转移的³²P或³⁵S标记探针杂合物。目前愈来愈多人运用非放射线标定技术来制备探针，如digoxigenin（DIG）、 biotin及其它物质。常见DNA探针制备方法则有nick translation、 random priming与polymerase chain reaction（PCR）等。此外，亦有对DNA进行end-labeling的方式，可用filling-in或kinase reaction。Filling-in是将DNA以5′-protruding的限制酶切开再补以Klenow酵素加上标定物把3′端补齐。Kinase reaction则是以 [g-³²P]ATP为phosphate donor利用T4 polynucleotide kinase的活性对带有5′-OH的DNA磷酸化。而正或反股RNA探针则可利用in vitro transcription来制备。

　

II.Random priming

1.DNA polymerase要进行DNA聚合反应时一定要有引子（primer），因为聚合酶可以引子所提供的3’-OH为起始点进行延伸（extension）的工作。引子一般可用机器合成出来，要进行特定DNA片段之复制时，固然可以根据已知DNA序列设计核酸引子，但也可以直接采用逢机引子（random primers）。所谓逢机引子即其序列为逢机序列，不经特别设计，目前应用最广者是以机器合成的6~8个核酸长的寡核苷酸混合物（oligonucleotides）。反应中若有任何一条逢机引子能结合到模板DNA上，即可引导DNA聚合反应之进行。此DNA聚合反应系由Klenow fragment（large fragment of E.coli DNA polymerase I）进行，在反应中添加[α-³²P] dNTP或DIG-11-dUTP等标定物质。然而为了避免random priming也发生在载体的部分，因此不以质体DNA直接当模板，而预先将目标DNA自载体中切出再分离纯化单独的目标DNA片段，以进行random priming反应。

2.仪器用具：

a. 桌上型离心机

b. 37℃恒温箱

c. 干浴器

d. 冰浴

3.药品及试剂：

a. 模板DNA: lacZ基因（3.2 kb, HindⅢ/EcoRI片段，参照实验3）

b. 0.2 M EDTA, pH 8.0

c. 4 M LiCl

d. random priming DIG Kit (Boehringer Mannheim; Roche)

e. 100% ethanol

f. TE buffer: 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA

4.方法步骤：

１）取100 ng模板DNA，加入去离子水成为15 ml。

２）于沸腾水中加热10分钟，迅速将微量离心管移至冰浴中，静置数分钟。

３）依序加入2 ml hexanucleotide mixture + 2 ml dNTP mixture + 1 ml Klenow enzyme，混合均匀，置于37 ℃中2小时。

４）加入2 ml 0.2 M EDTA以终止DNA聚合反应。

５）加入2.5 ml 4 M LiCl 及75 ml酒精，混合均匀，做酒精沈淀（参照实验4）。溶解DNA于50 ml TE buffer。

　

Ⅲ.PCR

1.如果目标DNA已被选殖至载体上，可以PCR扩增这段DNA片段，根据质体multiple cloning sites (MCS)两边的序列，选用适当的核酸引子对夹出目标DNA，在进行PCR反应时，若添加了[α-³²P] dNTP或DIG-11-dUTP，所增殖的DNA即被³²P或DIG所标定，故PCR是制备DNA探针非常便捷好用的方法。

2.仪器用具：

a. PCR机器

b. 桌上型离心机

c. 迷你电泳槽及铸胶器

3.药品及试剂：

a. 模板DNA：pINDlacZ (50 ng/ml)

b. 核酸引子对：HSP primer：5′-AACAAGTTACCGAGAAAGAAGAA-3′

                CR-gal primer：5′-ATCGTAACCGTGCATCTGCCAGTTT-3′

                        (covering lacZ gene 363-387 nts)

c. PCR DIG probe synthesis kit (Boehringer Mannheim; Roche)

4.方法步骤：

１）取一支0.2 ml薄壁PCR管，各加入下列各项：

	Volume (ml)
dH2O	28.5
10 x PCR buffer	5
10 x PCR DIG mix	5
HSP primer	5
CR-gal primer	5
pINDlacZ	1
Taq DNA polymerase	0.5
Total	50

２）设定PCR反应条件：

Denature: 94 ℃ for 1 min

30cycles: 94 ℃ for 1 min, 55 ℃ for 1 min, 72 ℃ for 2 min

Elongation: 72 ℃ for 7 min

３）将PCR管子置入反应器中进行反应。

４）取5 ml PCR产物进行电泳分析，观察约500 bp的产物。（参照实验10）

　

Ⅳ.杂交反应（Hybridization）

1.仪器用具：

a. 水浴槽

b. 热封口器

c. 冰浴

d. 平端镊子

2.药品及试剂：

a. probe：如前述

b. denatured salmon sperm DNA (100 mg/ml)

c. 50 x Denhardt’s solution：5 g Ficoll + 5 g polyvinylpyrrolidone + 5 g BSA fracitonⅤ,加水至500 ml通过0.45 mm膜过滤。

d. Southern/Northern blots （参照实验8及13 ）

e. 1.5 x 杂合缓冲溶液：117 g NaCl + 12.1 g Tris base + 0.7 g disodium EDTA + 2 g sarkosyl + 2 g Na₄P₂O₇∙10H₂O，加水至1 L，以HCl调pH至7.9，再加水至1.5 L。

f. 2 x SSC 含0.1% SDS

g. Whatman 3MM滤纸

h. 耐热塑料袋

i. 胶膜

3.方法步骤：

１）把blot放入耐热塑料袋中，加入15 ml 1.5 x 杂合缓冲液 + 4 ml 50 x Denhardt’s 溶液 + 0.2ml denatured salmon sperm DNA。

２）把袋中的空气挤出来并用封口器把袋子封住，置于68 ℃水浴中2小时。

３）把50 ml探针放入沸水中5分钟，迅速放至水浴中，静置数分钟。

４）加入400 ml水到探针中，把袋子一角剪掉，把探针放进去，再用封口器把剪口封住，置回68 ℃水浴中过夜。

５）将膜由袋中取出，放入含250 ml 2 x SSC + 0.1% SDS的玻璃盘中，在室温静置3分钟，重复此冲洗步骤。

６）把膜泡在250 ml 0.1 x SSC + 0.1% SDS冲洗膜，置放到Whatman 3MM滤纸上把溶液吸干。

Ⅴ.呈色反应

1.进行杂合反应时，所使用的探针若为放射性物质标定者，杂合讯息可经由放射显影技术（autoradiography）侦测出来。若为DIG phosphatase（AP）并利用碱性去磷酸的酵素活性转达的基质（substrate）为NBT（nitroblue tetrazolium）与BCIP（5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate, toluidinium salt），此外亦可选用CSPD或CPD-star等荧光物质来增加检测敏感度。

2.仪器用具：

a. 平端镊子

b. shaker

3.药品及试剂：

a. DIG nucleic acid detection Kit (Boehringer Mammheim; Roche)

b. Buffer 1：0.1 M maleic acid, 0.15 M NaCl, pH 7.5

c. Buffer 2：1% blocking reagent in buffer 1

d. Buffer 3：0.1 M Tris-HCl, pH 9.5, 0.1 M NaCl, 50 mM MgCl₂

e. Buffer 4：10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA

f. Washing soultion: 0.3% Tween 20 in buffer1

g. Color-substrate solution：200 ml NBT/BCIP stock solution plus 10ml buffer 3 (fresh prepared!)

4.方法步骤：

１）以50 ml washing solution浸洗尼龙膜1分钟。

２）把膜放入20 ml Buffer 2中30分钟，以便填充膜上非专一性结合部位。

３）取出2ml anti-DIG-AP-Ab并加10ml Buffer 2稀释，连同膜放入塑料袋中，除去气泡并封口，在50rpm振荡30分钟。

４）以50 ml Buffer 1浸洗尼龙膜2次，每次15分钟以除去多余之Ab。

５）将尼龙膜放入20 ml Buffer 3漂洗2分钟。

６）取出尼龙膜，放入10ml现配之呈色作用基质（color-substrate solution），置于暗处（抽屉）内作用，每隔几分钟检视之，待有紫色条带出现。

７）欲终止反应，将膜移至50 ml Buffer 4浸渍5分钟。

８）取出尼龙膜，滴干反应液后放于卫生纸上风干至少30分钟，加以护贝保存。