I.目的

 

    南方墨渍法使我们能从很复杂的DNA片段混合物中，鉴定出我们感兴趣的DNA片段或证明重组质体。我们可用限制酶切割DNA，而产生一些DNA片段，再跑agarose gel电泳。本实验是将洋菜胶上的DNA吸出而固定于转移基质上，且让DNA片段仍保留在原有的相对位置上，再以DNA作为探针（probe）进行杂合分析（hybridization），而找出我们感兴趣的片段。

 

    转移基质原以硝化纤维膜（nitrocellulose membrane）为主，DNA固定需要烘烤长时间，滤纸烘烤后常变易脆。后来转移基质改成尼龙膜（nylon membrane），DNA固定可用UV crosslinker，数秒即可完成，同时易清洗，只要暴露于低盐高温即可把墨渍清掉可再做侦测之用。

 

　

 

II.南方墨渍法（Southern blotting）

 

1.仪器用具：

 

a. 水浴槽

 

b. 转渍玻璃槽与2吋玻璃平台

 

c. 手提式短波UV光

 

d. UV crosslinker

 

e. 烤箱

 

f. 热封口器

 

2.药品及试剂：

 

a. 5 x denature buffer：2 M NaOH, 4 M NaCl

 

b. 1 x neutralization buffer：0.5 M Tris-HCl, pH 7.6, 1.5 M NaCl

 

c. 100% ethanol

 

e. nitrocellulose or nylon membrane

 

f. 20 x SSC：0.3 M sodium citrate, pH 7.0, 3 M NaCl

 

g. Whatman 3MM滤纸

 

h. 耐热塑料袋

 

i. 纸巾（吸水纸）

 

3.方法步骤：

 

１）实验7所留的电泳胶片暴露于紫外光下30秒，使DNA产生缺口，如此转移到基质的情形较为理想。

 

２）把胶片放在玻璃盘内，加入400 ml 1 x neutralization buffer，轻轻振荡30分钟。

 

３）倒去denature buffer，用蒸馏水冲洗胶片，在加入400 ml 1 x neutralization buffer，轻轻振荡30分钟。

 

４）剪裁同胶片大小的膜。（若用nitrocellulose，浸泡蒸馏水中5分钟）

 

５）剪一迭Whatman 3MM滤纸比膜大1/8吋，另外每片胶片需4条1´6吋parafilm，另剪一迭6吋厚的纸巾大小与胶片同。

 

６）在转渍玻璃槽中放入平台，加入10 x SSC至平台下方，如图示。

 

７）一些Whatman 3MM滤纸当作灯蕊，以10 x SSC弄湿，两端浸在10 x SSC中，玻棒在滤纸上滚动把气泡赶走。把胶片放在灯蕊上，下方四周以parafilm阻隔，上方则放membrane，亦以玻棒赶去气泡。将两张Whatman 3MM滤纸弄湿放在膜上，亦赶去气泡。在滤纸上放一迭纸巾，最后在纸巾上放一个1.5磅的重物，让转移进行一个晚上。

 

８）拿掉膜上之物，在膜上画记槽的位置（well）及标定方向（或截角）。

 

９）若使用硝化纤维膜，可用400 ml 2 x SSC冲洗以去除小块胶粒，把膜放在2张Whatman 3MM滤纸上吸去多余的溶液。用铝箔纸包住膜，放在真空烤箱中以70 °C烘烤90分钟。若使用尼龙膜，将面对胶片的一面向上，放入UV crosslinker内20秒以固定DNA。

 

10）把固定好的膜装在耐热塑料袋（plastic boiling bag）中，用加热封口器把袋子封住。