I.目的

检定载体上是否接上了外来的DNA片段，常因质体不同而有不同的方法。基本上一般常见的检定方法有以下几种，第1种是外来DNA片段的插入导致载体某种表现型的丧失（insertional inactivation）作为筛选的依据。第2种是利用插入的DNA上带有宿主菌株不具有的表现型进行筛选。第3种若载体与插入DNA片段上皆无适当的筛选依据，则可将转形株中的质体抽出后，以限制酶切割再进行电泳分析。

本实验中所用的质体pT7-6并无简易快速筛选重组质体的方法可利用，利用lacZ基因表现b-gal尚须具T7 promoter之菌种，故无法以X-gal机制分解使菌落呈现蓝色。最后我们必须利用传统的方法，自菌落中抽取质体DNA再以洋菜胶做电泳分析。

II.重组DNA（recombinant DNA）之检定

1.仪器用具：

a. 桌上型离心机

b. 抽风柜

c. 37 °C恒温箱

d. 迷你电泳槽及铸胶器

e. UV transilluminator

f. 拍立得相机或数字元影像分析系统

2.药品与试剂：

a. 限制酶：HindIII及EcoRI

b. 10 x Restriction buffer B: 100 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM MgCl2, 1 M NaCl, 10 mM 2-mecaptoethanol

c. 其它参照实验1~4

3.方法步骤：

１）由实验6转形得到的正反应(positive)菌落，分别接种于Amp plate（当作template）及3 ml LB+Amp培养液中，标明编号，置于37 °C振荡培养过夜。

２）进行小量质体DNA之抽取（参照实验1）。

３）每一株各取3ml质体DNA以HindIII/EcoRI切割，另取pT7-6亦做限制酶切割以为对照（参照实验3）。

４）以1% agarose gel进行电泳分析（参照实验3），由电泳图谱中挑选带有lacZ基因片段即为重组质体。

注：电泳胶片在照相后不要丢弃，请保留继续进行Southern blotting。

Ⅲ.重组DNA快速检定法

1.此方法系以phenol/chloroform溶菌后直接进行电泳分析，并未将质体DNA与宿主染色体DNA分离，得到的DNA也不能用限制酶切割。但因其快速简便，所以可藉之于短时间内检定大量转形株中质体DNA的相对分子量，以初步筛选带有重组质体的转形株。

2.仪器用具：

同上

3.药品及试剂:

a. 1 x STE : 20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA

b. phenol/chloroform/isoamyl alcohol (PCI)

c. RNase A

4.方法与步骤:

１）由实验6得到的转形株，以接种环将菌体刮下，分别接种于Amp plate（当作template）再悬浮大部分菌体于30 ml 1 x STE中，振荡混合均匀。（最好有pT7-6的菌体做相同的处理以为对照）

２）加入30 ml PCI，剧烈振荡。

３）12,000 rpm离心3分钟。

４）把上层水溶液相转移至另一干净的离心管，加入1 ml RNase A及3 ml 10x 追踪染剂，以50 V进行电泳分析。

５）以泳电率对应分子量大小，选取质体分子量大约于pT7-6者，即为重组质体。