限制性内切酶酶切反应
作者: 来源:
一、实验方案
1.反应一般在灭菌的0.5ml离心管中进行。
2.20μl体积反应体系如下：
DNA 0.2-1 μg
10×酶切buffer 2.0 μl
限制性内切酶 1-2 u
加ddH2O 至 20 μl
限制性内切酶最后加入，轻轻混匀，稍加离心，放置于最适温度水浴并按所需的时间温育，一般为37℃水浴消化1h。
3.用于回收酶切片段时，反应总体积可达50-200μl，各反应组分需相应增加。
4.多种酶消化时若缓冲液条件相同，可同时加入；否则，先做低温或低盐的酶消化，再做高温或高盐的酶消化。
5.酶切结束时，加入0.5M EDTA（pH 8.0）使终浓度达10mM，以终止反应。或将反应管在65℃水浴放置10min以灭活限制性内切酶活性。
6.如消化反应体积过大，电泳时加样孔盛不下，可加以浓缩：终止反应后，加入0.6体积的5M 乙酸铵（或1/10体积3M NaAc）和2倍体积无水乙醇，在冰上放置5min，然后于4℃离心12000g，5min。倾去含大部分蛋白质的上清液。于室温晾干DNA沉淀后溶于适量TE中（pH 7.6）。
7.如要纯化消化后的DNA，可用等体积酚/氯仿（1∶1）和氯仿各抽提一次，再用乙醇沉淀。
二、电泳检测
取酶切产物适量，加1/2体积的loading buffer混匀上样，以未经酶切的质粒或/和酶切的空载体（如有）作对照，进行电泳。
三、注意事项
1. 选择适当的限制酶缓冲液，一般酶的说明书中会明确。
2. 购买的限制性内切酶多保存于50%甘油中，应尽量减少反应体积，但要确保酶体积不超过反应总体积的10%，否则酶活性将受到甘油的抑制。
1.反应一般在灭菌的0.5ml离心管中进行。
2.20μl体积反应体系如下：
DNA 0.2-1 μg
10×酶切buffer 2.0 μl
限制性内切酶 1-2 u
加ddH2O 至 20 μl
限制性内切酶最后加入，轻轻混匀，稍加离心，放置于最适温度水浴并按所需的时间温育，一般为37℃水浴消化1h。
3.用于回收酶切片段时，反应总体积可达50-200μl，各反应组分需相应增加。
4.多种酶消化时若缓冲液条件相同，可同时加入；否则，先做低温或低盐的酶消化，再做高温或高盐的酶消化。
5.酶切结束时，加入0.5M EDTA（pH 8.0）使终浓度达10mM，以终止反应。或将反应管在65℃水浴放置10min以灭活限制性内切酶活性。
6.如消化反应体积过大，电泳时加样孔盛不下，可加以浓缩：终止反应后，加入0.6体积的5M 乙酸铵（或1/10体积3M NaAc）和2倍体积无水乙醇，在冰上放置5min，然后于4℃离心12000g，5min。倾去含大部分蛋白质的上清液。于室温晾干DNA沉淀后溶于适量TE中（pH 7.6）。
7.如要纯化消化后的DNA，可用等体积酚/氯仿（1∶1）和氯仿各抽提一次，再用乙醇沉淀。
二、电泳检测
取酶切产物适量，加1/2体积的loading buffer混匀上样，以未经酶切的质粒或/和酶切的空载体（如有）作对照，进行电泳。
三、注意事项
1. 选择适当的限制酶缓冲液，一般酶的说明书中会明确。
2. 购买的限制性内切酶多保存于50%甘油中，应尽量减少反应体积，但要确保酶体积不超过反应总体积的10%，否则酶活性将受到甘油的抑制。
@2009-i236.com,contact us by i236@i236.com