感受态制备

1、将培养液转入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃下3000g离心10分钟。

2、弃去上清,用预冷的0.05M 的CaCl₂溶液1ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4℃下3000g离心10分钟。

3、弃去上清,加入400μl预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。

4、分装成200μl的小份,贮存于-70℃可保存半年。

转化

1、从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液,室温下使其解冻,解冻后立即置冰上。

2、 加入质粒DNA溶液(含量不超过50ng,体积不超过10μl),轻轻摇匀,冰上放置30分钟后。

3、42℃水浴中热击90秒，热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。

4、向管中加入1ml LB液体培养基(不含抗生素),混匀后37℃振荡培养1小时,使细菌恢复正常生长状态。

5、将上述菌液摇匀后取100μl 涂布于含相应抗生素的筛选平板上, 37℃倒置培养16-24小时。

同时做两个对照:

对照1: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。

对照2: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但涂板时只取10μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。