1 目的要求

（1）熟悉噬菌体与宿主菌的相互关系。

（2）学习与了解噬菌体的分离，纯化，噬菌体效价的计量单位及测定方法。

2 基本原理

以细菌当作寄主的病毒称为噬菌体（bacteriophages）。噬菌体效价的计量单位是pfu和RTD。pfu是噬斑形成单位（phages forming units），表示形成一个噬斑所需有感染能力的最少噬菌体数量，以pfu/mL表示。RTD是常规试验稀释度(routine test dilution)，一般以平板上滴加噬菌体的部位刚刚能够出现的噬菌体稀释度。噬菌体有严格的寄生性，须在活的易感的细菌体内增殖，并能将菌体裂解，噬菌体对相应的细菌有强大的溶菌力和严格的种型特异性，因而可用于细菌的鉴定、分型，检测标本中未知细菌和防治某些疾病。

3 材料与试剂

3．1 仪器  温箱（36+1℃）、恒温水浴锅、微波炉。

3．2 材料  吸管（0.1mL、1mL及10mL）、平皿、酒精灯、试管架、L型玻璃棒、薄膜滤器（孔径0.45um）。

3．3 培养基及样品  营养琼脂，营养肉汤，污水等。

4 实验方法与步骤

4．1 噬菌体的分离

每份未处理污水样品取100mL加入到呈轻度混浊的宿主菌培养物（营养肉汤6 mL）中，混合后，36℃培养18h，观察培养液是否浑浊。若培养液透明，表明有噬菌体存在；如果培养液微浑或浑浊，则通过孔径为0.45μm薄膜滤器，检查滤液中是否有噬菌体存在。因为初次分离时，即使有噬菌体存在，不足以完全溶解所有细菌，所以培养液会有不同程度的浑浊。通常也采用斑点试验法检查噬菌体。具体步骤为：

（1）将宿主菌肉汤培养物（2h）用营养肉汤作1：100稀释后涂布在己烘干的营养琼脂平板的表面使成一薄层，放置数分钟，使液滴被琼脂吸干。

（2）倒转平板，在36℃培养过夜，次日检查结果，如有少量噬菌体存在，则在琼脂表面滴加滤液的部位出现孤立的噬斑，如有大量噬菌体存在，则噬斑融合，形成裂解区。

4．2 单斑纯化

根据斑点试验法的结果，估计滤液内噬菌体的数量。

（1）将滤液按百倍稀释法作两次连续稀释，即吸取0.02mL，稀释在2mL肉汤内，使成10^-2，再吸取此稀释液0.02mL，稀释在2mL肉汤内，使成10^-4。

（2）以琼脂双层法作单斑分离，融化营养琼脂倾注在一个直径9cm平皿内，在水平台面上使其凝固，然后在36℃半开皿约一小时以烘干表面水分。

（3）加热融化装有2.5mL半固体琼脂试管并置于55℃水浴箱内保温，临用时取出。

（4）将0.1mL稀释滤液、0.1mL宿主菌2小时肉汤培养物加入到2.5mL已融化好的半固体琼脂试管中混和均匀，立即倾注到准备好的琼脂平板上面，覆盖整个表面，在水平台上使其凝固，36℃下培养过夜，次日检查结果。

（5）次日，用接种针接触噬斑中央并略靠近边缘有菌的部分，放在小试管营养肉汤管壁上研磨洗入肉汤内。用同样方法，单斑纯化3次，如果在平板上仍有大小不等的噬斑出现，还须进行再次纯化。

4．3 pfu的测定

将装有2.5mL的半固体琼脂试管加热融化，放在55℃水浴箱内保温。临用取出，每管加入不同稀释度的噬菌体液0.1mL及4小时宿主菌肉汤营养物0.1mL，混和均匀后倾注到准备好的琼脂平板上，覆盖整个表面并在水平台面上使其凝固。一般做三个稀释度，即10^-4，10^-6，10^-8，36℃下培养过夜，次日检查结果。选取噬斑数在30～300范围内的平板，作噬斑计数，记录结果N。

例如：噬菌体稀释液为10^-8，0.1mL内N为140。

                     N       =      140      =140×10⁹=1.4×10¹¹pfu/mL

                稀释度×0.1        10^-8×0.1

 

4． 4 RTD的测定

将宿主菌肉汤培养作1:100~1:200稀释，即挑取1~2满环，稀释在1mL肉汤内。依次挑取1环，在琼脂平板上作斑点状涂抹，斑点的直径约1mm，共涂抹10个菌斑。略等数分钟，待菌斑表面水分干燥后在每个菌斑的中央依次滴加噬菌体稀释液0.01mL（配4¹/₂号针头的乳头滴管，每1mL约为100滴；或直径为3mm接种环，每个满环约为0.05mL）。共做10个稀释度，即原液，10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7，10^-8，10^-9。如用一个滴管加不同稀释度的噬菌体，应从高稀释度开始。待滴加的噬菌体液被琼脂吸干后，倒转平皿，在36℃培养5h或过夜检查结果。能产生融合性裂解的噬菌体最高的稀释度，即是该噬菌体的RTD。由于在两个稀释度之间有10倍的间隔，结果的判定不够精确，常可在两个稀释度之间插入几个稀释度，例如在10^-4~10^-5之间插入：

      1:1.6×10^-4，  即：10^-4稀释液1mL加肉汤0.6mL

      1:2.5×10^-4，  即：10^-4稀释液1mL加肉汤1.5mL

      1:4.0×10^-4，  即：10^-4稀释液1mL加肉汤3.0mL

      1:6.3×10^-4，  即：10^-4稀释液1mL加肉汤5.3mL

 

5 实验结果

将实验结果按下表标准记录

融合性裂解 程度的表示	融合性裂解 的程度	噬斑的数量与判定标准	本实验噬斑的数量 及判定结果
CL	融合性裂解	―	0～5
<CL	次于融合性裂解	±	6～20
SCL	半融合性裂解	+	21~40
<SCL	次于半融合性裂解	++	61~80
OL	不透明融合性裂解	+++	>120

 

6注意事项

（1）噬菌体液的稀释：为了减少稀释中的技术误差，稀释噬菌体液一般作连续百倍稀释。即吸取0.02mL稀释在2mL肉汤内；使成10^-2；另换吸管，吸取此稀释液0.02mL稀释在2mL肉汤内；使成10^-4；再换吸管，依次作10^-6和10^-8稀释。吸管内肉汤按吹出量计算，决不可把吸管插入新的肉汤管内，更不可在新肉汤管内吹吸。如还要作成10^-3和10^-5稀释，可分别取10^-2和10^-4稀释液0.2mL，稀释在1.8mL肉汤内。

（2）注意供纯化用的平板上噬斑数不宜太多，在一个平板上，中等大小的噬斑一般不超过200个，且要求噬斑之间必须有足够的空隙。