基本原理

自然界微生物是以混杂的状态存在的。分离和纯化的目的是从各种样品来源混杂的微生物群体中获得纯种微生物，即在一定的条件下培养、繁殖得到只有一种微生物的培养物也称为纯培养物（pure　cuLture）。分离纯化微生物的方法有很多种，但基本原理相似，一般是将待分离的样品进行一系列的稀释，使稀释样品中的微生物或孢子呈分散状态，然后在适宜的培养基和培养条件下长出单菌落，再将单菌落转移培养。重复此过程二、三次便可获得纯种微生物。常用的分离纯化的方法有稀释倒平板法、平板划线分离法、涂布平板法、亨盖特稀释滚管法、.单细胞（单孢子）挑取法、利用选择培养基进行分离等。大多数好气且数量大的微生物可采用稀释倒平板法和平板划线分离法进行分离，热敏菌和严格好氧菌可采用涂布平板法，而严格厌氧菌则需采用稀释滚管法，对于比较大而个体数少的单细胞和单孢子可采用单细胞（单孢子）挑取法，对于那些生长慢，营养要求或生长条件特殊的微生物需利用选择培养基结合其他方法进行分离。

实验方法与步骤

1.稀释倒平板法

梯度稀释：准确称取待分离土样或食品样品2.5g，放入装有22.5mL无菌水的三角瓶中，用手或置摇床上震荡20min，使微生物细胞分散，静置15min，即成10^-1稀释液，再用1mL无菌吸管，吸取10^-1稀释液1mL，移入装有9mL无菌水的试管中，吹吸几次，让菌液混合均匀，即成10^-2稀释液；再换一支无菌吸管吸取10^-2稀释液1mL，移入装有9mL无菌水的试管中，吹吸几次，即成10^-3稀释液，以此类推，连续稀释，制成10^-5、10^-8系列稀释菌液。

倒混菌平板：分别取10^-5、10^-8稀释液少许，与已熔化并冷却至50^oＣ左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板。

保温培养：将平板倒置于30^oＣ的恒温培养箱中培养24~48h，即可出现菌落。如稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这些菌落有可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。

挑单菌落：挑取单个菌落，转移至液体培养基中增菌，再重复以上操作数次，便可得到纯培养。（如图 1）

2.涂布平板法

倒混菌平板可能会影响热敏菌和严格好氧菌的生长而使这些菌无法很好分离出，相应可采用涂布平板法。其做法是先将已熔化的培养基倒入无菌平皿，制成无菌平板，冷却凝固后，将一定量（0.1或0.2mL）的某一稀释度的样品悬液滴加在平板表面，再用无菌玻璃涂棒将菌液均匀分散至整个平板表面，经培养后挑取单个菌落（如图2所示）。重复此过程数次，即可分纯菌种。

3.平板划线法（streak plate method）

点燃酒精灯，在火焰旁进行如下操作。用接种环以无菌操作沾取少许待分离的液体样品，在无菌平板表面进行平行划线、连续化线、交叉划线、扇形划线、方格划线或其他形式的划线，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。（如图3所示）