1 目的要求

（1）了解食品和食物中毒样品中溶血性链球菌的检测方法。

（2）观察溶血性链球菌的革兰氏染色镜检形态以及在血平板上菌落特征及溶血情况。

（3）观察乙型溶血性链球菌产生链激酶的现象以及杆菌肽敏感实验结果。

2 基本原理

乙型（β）溶血性链球菌致病性强，能产生溶血毒素，在血平板上生长，可使菌落周围形成一个有2～4mm宽，界限分明，完全透明的无色溶血环，称乙型溶血；还能产生链激酶（又称溶纤维蛋白酶），激活血浆中的血浆蛋白酶原，使之变成活动性的血浆蛋白酶，故可溶解血块或阻止血浆凝固；还可以产生胞外cAMP因子，它可以增强葡萄球菌的溶血能力，即增强对羊、牛血红细胞的溶解能力。因此，在羊血琼脂平板上接种链球菌处，可以见到蘑菇状或箭头样的溶血区。

3 实验材料

3．1设备和材料  温箱、水浴、显微镜、离心机、试管架、灭菌平皿、灭菌小试管、载玻片、灭菌吸管（1mL、10mL）灭菌镊子、均质器、酒精灯、接种环。

3．2培养基和试剂  葡萄糖肉浸液肉汤、牛心浸液、匹克氏肉汤、血琼脂平板、人血浆、0.25%氯化钙、灭菌生理盐水、杆菌肽药敏纸片(含0.04单位)。

4 实验方法与步骤：

4．1溶血性链球菌检验程序

4．2 样品处理

称取25g固体检样或称取25mL液体检样，加入225mL灭菌生理盐水制成混悬液。

4．3 一般培养

将上述混悬液吸取5mL，接种于50mL葡萄糖肉浸液肉汤或直接划线接种于血平板，如检样污染严重，可同时按上述量接种匹克氏肉汤，经36±1℃培养24h后接种血平板，置36±1℃培养24h，挑取乙型溶血圆形突起的细小菌落在血平板上分纯，然后观察溶血情况及革兰氏染色，并进行链激酶试验及杆菌肽敏感试验。

4．4 形态与染色

本菌呈球形或卵圆形，直径0.5～1μm，链状排列，链长短不一，短者4～8个细胞组成，长者20～30个，链的长短常与细菌的种类及生长环境有关；液体培养中易呈长链；在固体培养基中常呈短链，不形成芽孢，无鞭毛，不能运动。

4．5 培养特性

该菌营养要求较高，在普通培养基上生长不良，在加有血液、血清培养基中生长较好。溶血性链球菌在血清肉汤中生长时，管底呈絮状或颗粒状沉淀。血平板上菌落为灰白色，半透明或不透明，表面光滑有乳光，直径约0.5～0.75m，为圆形突起的细小菌落，乙型溶血链球菌周围有2～4mm界限分明、无色透明的溶血圈。

4．6 链激酶试验

致病性乙型溶血性链球菌能产生链激酶(即溶纤维蛋白酶)，此酶能激活正常人体血液中的血浆蛋白酶原成为血浆蛋白酶，而后溶解纤维蛋白。

吸取草酸钾血浆0.2mL，加0.8mL灭菌生理盐水混匀，再加入18～24h 36±1℃培养的链球菌培养物0.5mL及0.25%氯化钙0.25mL(如氯化钙已潮解，可适当加大至0.3%～0.35%)，振荡摇匀，置于36±1℃水浴中10min，血浆混合物自行凝固 (凝固程度至试管倒置，内容物不流动)。然后观察凝固块重新完全溶解的时间，完全溶解为阳性。若24h后不溶解即为阴性。

草酸钾人血浆配制：草酸钾0.01g放入灭菌小试管中，再加入5mL人血(新鲜)混匀，经离心沉淀吸取上清液即为草酸钾人血浆。

4．7 杆菌肽敏感试验

挑取乙型溶血性链球菌液涂布于血平板上，用灭菌镊子夹取每片含有0.04单位的杆菌肽纸片放于上述平板上，置于36±1℃下培养18～24h，如有抑菌带出现即为阳性。同时用已知阳性菌株作为对照。

5 实验结果

（1）溶血性链球菌涂片染色镜检为革兰氏阳性，呈球形或卵原形直径为0.5～1微米，链状排列，链的长短不一，短者由4～8个菌体组成，长者达20～30个菌。液体培养基中易呈长链，固体培养基中常呈短链。

（2）溶血性链球菌在血平板上形成的菌落为灰白色，半透明，表面光滑有乳光，直径约为0.5～0.75mm的圆形突起的细小菌落。乙型溶血性链球菌菌落周围呈完全溶血，并有明显的溶血境界。在显微镜低倍镜下观察，菌落周围一般不能见到红血球。乙类溶血性链球菌在血平板上对杆菌胎敏感，经37℃培养18小时，出现明显抑菌圈。