1.基本原理

黄曲霉毒素的检测方法很多，其中薄膜层析法和液相色谱法是目前国内绝大多数检测机构都在使用的方法，它的缺点是检测周期长、程序复杂、所需试剂繁多，已不能满足现代检测要求。随着现代科学技术的不断发展，人们已创建了不少快速、简便、特异、敏感、低耗且适用的黄曲霉毒素检测方法。尤其免疫学方法应用较多，例如：酶联免疫吸附，免疫亲和柱法，免疫层析法等，虽然这些方法优点很多，但由于检测费用较高，无法普及。现今先进国家广泛使用的金标试纸法是一个检测方面的新亮点。

本试验采用间接性酶联免疫方法测试花生中的黄曲霉毒素B1。其基本原理为：已知抗原吸附在固态载体表面，洗除末吸附抗原，加入一定量抗体与待测样品(含有抗原)提取液的混合液，竞争培养后，在固相载体表面形成抗原抗体复合物。洗除多余抗体成分，然后加入酶标记的抗球蛋白的第二抗体结合物，与吸附在固体表面的抗原抗体结合物相结合，再加入酶底物。在酶的催化作用下，底物发生降解反应，产生有色物质，通过酶标检测仪测出酶底物的降解量，从而推知被测样品中的抗原量。

2 实验材料

2．1 试剂与溶液 抗黄曲霉毒素B₁单克隆抗体，人工抗原(AFB₁－牛血清白蛋白结合物),黄曲霉毒素B₁标准品，三氯甲烷，甲醇，石油醚，邻苯二胺(OPD)，辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗鼠IgG，过氧化氢(H₂O₂)，硫酸，ELISA缓冲液，包被缓冲液，洗液(PBS－T)，抗体稀释液，底物缓冲液，封闭液。

2．2 仪器与用具 研钵、摇床、酶标仪、水浴锅、培养箱、酶标板、微量加样器、吸头、具塞锥形瓶、20目筛、移液管、量筒、烧杯、定性滤纸、蒸发皿、分液漏斗、具塞试管。

3 实验方法与步骤

3．1 花生的毒素提取

样品去壳去皮捣碎、研磨后称取20.0g，加入250mL具塞三角瓶中，准确加入100.0mL甲醇-水(55：45)溶液和30mL石油醚。盖塞后150r/min振荡30min。静置15min后用快速定性滤纸过滤于125mL分液漏斗中。

放出下层甲醇－水溶液于100mL烧杯中，从中取20.0mL置于另一125mL分液漏斗中，加入20.0mL三氯甲烷，振摇2min，静置。

将三氯甲烷收集于75mL蒸发皿中，再加5.0mL三氯甲烷于分液漏斗中重复上一步骤，一并收集三氯甲烷于蒸发皿中，65℃水浴通风挥干。

用2.0 mL 20%甲醇-PBS分三次（0.8mL、0.7mL、0.5mL）溶解并彻底冲洗蒸发皿中凝结物，移至小试管，加盖振荡后静置待测。此液每毫升相当于2.0g样品。

3．2 酶联免疫吸附测定(ELISA)

⑴ 包被微孔板

用AFB₁－BSA人工抗原包被酶标板，100μL/孔，4℃过夜。阴性对照：在已包被好的酶标板孔中，加入7%甲醇PBS液与AFB1抗体，再加羊抗兔-辣根过氧化物酶，其OD值最高；空白对照孔：不包被AFB1-蛋白结合物，以下操作与阴性对照孔相同，其OD值最低。

⑵ 封闭

已包被的酶标板用洗液洗3次，每次3min后，加封闭液封闭，250μL/孔，置37℃下1h。

⑶ 抗体抗原反应

酶标板洗3×3min后，加抗体抗原反应液，100μL/孔，37℃，2h，以抗体稀释液为阴性对照；将黄曲霉毒素B₁纯化单克隆抗体稀释后分别与等量样品提取液用2mL试管混合振荡后，4℃静置15min。此液用于测定样品中黄曲霉毒素B₁含量。

⑷ 酶标记反应

酶标板洗3×3min，加酶标二抗(1:2000，V/V)100μL/孔，1h。

⑸ 显色反应

酶标板用洗液洗5×3min；加底物溶液(1mg OPD)，加2.5mL底物缓冲液，加37μL30% H₂O₂，待底物充分溶解后加入酶标板，100μL/孔，37℃，15min反应。

⑹ 终止

加2mol/LH₂SO₄，40μL/孔，终止反应。

⑺ 测定

酶标仪490nm测出OD值。

4 实验结果

（1）求出各孔的吸收校正值。

吸收校正值=吸收实测值－空白对照孔吸收值(均值)。

（2）求出待测样的吸收值

吸收(%)=[吸收校正值÷阴性对照孔吸收校正值(均值)]×100%。

（3）求出待测样AFB1含量(ng/g)

将待测样的吸收(%)值带入标准竞争抑制曲线，算出AFB1含量。（GB/T 5009.22—1996中，从标准曲线直接求得的数值，即为所测样品中黄曲霉毒素B₁的浓度）。