实验目的

1.学习植物原生质体的分离制备技术，观察原生质体的形态。

2.学习植物原生质体的融合技术，观察不同方法融合细胞的形态及变化。

实验用品

显微镜，擦镜纸，剪子，镊子，小平皿，吸管四支，直式漏斗，300目尼龙网，10ml离心管，载片，盖片。

实验原理

原生质体（protoplast）这个术语最早是由Hanstein在1880年提出来的。确切地说，食用菌原生质体是指细胞壁完全消除后余下的那部分包裹的裸露的细胞结构。

植物的花瓣细胞在经过纤维素酶，离折酶处理后，纤维素和果胶成分遭到破坏，造成原生质体脱离细胞壁进入培养液中。

植物花瓣细胞中的大液泡中存在有大量色素，且不同的细胞色素不同，因此可以在不对细胞染色的情况下，通过颜色范围辨认不同细胞的原生质体，以及同种间细胞融合和异种间细胞融合情况。

PEG是一种高分子化合物，由于含有醚键而具有负极性，与水，蛋白质和碳水化合物等一些正极化基团形成氢键。当PEG分子足够长时，可作为邻近原生质体表面之间的分子桥而使之粘连。PEG也能连接Ca2+等阳离子。Ca2+可在一些负极化基团和PEG之间形成桥，因而促进粘连，在洗涤过程中，连接在原生质体膜上的PEG分子可被洗脱，这将引起电荷的紊乱和再分布，从而引起原生质体融合，高Ca2+高pH清洗则增加了质膜的流动性，因而大大提高了融合频率，洗涤时的渗透冲击对融合也可能起作用。

实验试剂

1.洗涤液：

甘露醇 0.6 M

CaCl2.2H2O 8 mM

NaH2PO4?H2O 2 Mm

pH5.6

实验步骤

1.酶液的制备 把纤维素酶（EAS－867）溶于0.5～0.7摩尔/升甘露醇内，加10毫摩/升氯化钙溶液作稳定剂。酶溶解后，经4000转/分离心机沉降原生质体，20分钟后，取上清液。经针筒型过滤器，再经0.45微米微孔滤膜过滤后，在无菌箱内把酶液分装在三角烧瓶内，贮存在冰箱里备用。

2.材料准备 把生长在温室，苗龄60天以上的烟草植株，取上中部全展叶，在日光下照射2小时，使它萎蔫。也可以用温室生长的蚕豆叶作同样处理，或用大田收获的胡萝卜，放在0℃以上低温备用。萎蔫后的叶片浸在3%的漂白精片溶液中15～20分钟，再用无菌水冲洗干净，用无菌吸水纸吸干表面水分。

3.酶解 用尖头镊子撕去叶片下表皮，剪成小块。胡萝卜则用刀片削去表皮和中柱，取用皮层部，切成小块。以上材料1克，放入盛有10毫升酶溶液的培养皿里，加盖。在28～30℃下保温1.5～3小时。

4.洗涤 叶片或其他组织经酶解后会出现圆形的游离原生质体，原生质体悬浮液内有未消化的组织、碎片、细胞和破裂的原生质体。用滤纸或尼龙布滤去粗杂质，再把原生质体悬浮液移到离心管，用手摇离心机转动2分钟，吸去上清液（见图），再加入0.5毫升甘露醇洗涤2～3次，最后就得到较为纯净的原生质体，可以供进一步培养或作其他实验用。