实验目的

 

学习植物染色体标本的制备技术，了解Feulgen反应的基本原理,学习其操作方法和压片法,初步掌握细胞分裂各期的主要特点.

 

核酸是生物最重要的组成成分,核酸分为两大类,即脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA).它们在细胞内的分布及化学性质均有所不同.DNA主要分布在核的染色质或有丝分裂过程中出现的染色体内.RNA分布在细胞质和核仁内.但在染色质及染色体中也含有少量的RNA,核仁中也有少量的DNA.在线粒体,叶绿体等细胞器内除含有RNA外,也含有少量的DNA.

 

实验原理

 

Feulgen反应的原理是根据DNA经弱酸(1mol/L)水解后,打开料嘌呤和脱氧核糖连接的键,在脱氧核糖的一端形成有离的醛基.这些醛基就在原位与Schiff试剂结合,形成含醌基( )的化合物,醛基是一个发色团所以具有颜色,因此凡有DNA的部位,就呈现紫红色。 

实验材料 

大麦、黑麦或小麦种子

实验内容

植物染色体标本的制备及DNA的显示法-Feulgen反应

压片法

 

细胞有丝分裂相的观察

 

实验步骤

 

（一）植物染色体标本的制备

 

1、将植物种子放在潮湿的滤纸上，20°C发芽，待胚根长至1～2cm时，切取0.5cm长的根尖部分。

 

2、预处理：将切下的根尖浸入0.1%秋水酰素液中，室温下处理3～4小时。

 

3、固定、水解及染色：

 

Camoy固定剂

 

固定10-30分钟 ➞ 95%酒精10分钟 ➞ 70%酒精10分钟 ➞ 蒸馏水 →(对照) 5%三氯醋酸 ➞ 90oC 15分钟

 

➞ 1mol/L HCl ← 蒸馏水 ➞ 1mol/L HCl ➞ 60 oC 8分钟 ➞ Schiff试剂40 -60分钟 ➞ 亚硫酸水(1,2,3) ➞ 换3次,每次5分钟自来水 ➞ 将染色后的根尖漂洗干净,悬着染色效果好的材料 ➞ 蒸馏水 ➞ 压片 ➞ 镜检

 

(二) 压片法

 

压片的操作步骤如下,把根尖放在载片上,用刀片切取根尖(0.3cm),纵切根尖,加一滴水,用解剖针将根尖纵向分成若干小条,保留1-2小条,加盖玻片,用铅笔端轻轻敲击盖玻片,使细胞分离,压平呈云雾状.

 

（三）蚕豆(或洋葱)根尖压片的观察

 

首先在低倍镜下,区分根尖的分生组织区及延长组织区的细胞,然后,在高倍镜下,观察细胞核的形态,注意在你的片子上,是否有有丝分裂细胞,如有,你能找到细胞分裂期的几个阶段,其特征如何 (可参照附录)

 

做Feulgen反应时,应注意的几个问题

 

固定剂的选择:一般常选用Carnoy固定液.其他的固定剂如Flemming固定剂及Champy固定剂等均可用,但不能使用Bouin固定剂.

 

水解时间:水解时间一定要合适,不宜过长或不足,否则会影响实验结果.如用Carnoy固定液固定的材料,水解时间一般在8-15分钟之间.水解时间的长短要随不同的材料及不同的固定剂而定.

 

Schiff试剂的质量:在做Feulgen反应时,重要的因素就是Schiff试剂的质量问题.实验时,要注意试剂颜色是否正常,有无SO2的气味.

 

洗涤剂的重要性:漂洗时,所用的亚硫酸水,最好在每次实验前临时配制,以便保持较浓的SO2.

 

实验对照组:一定要做对照片,以便说明实验结果的真实性.

 

操作过程中,用镊子镊取根尖的生长区部位,切勿夹取根冠部位.

 

鸦片过程中尽量使根尖分生组织细胞保持原来的分布状态.

 

习题

 

简述Feulgen反应的原理

 

欲得到一张好的Feulgen反应制片,制片过程中应注意些什么

 

绘制细胞分裂图。