标签：热激；烟草细胞；凋亡检测

原理：

细胞凋亡受到严格的由遗传机制所决定的程序化调控所以也被称为细胞程序死亡。而坏死是指由于各种致病因子（如局部缺血、缺氧、理化因素干扰）的干扰而终断了细胞正常代谢活动而造成的细胞意外死亡，这两者主要的区别是在坏死过程中，细胞膜破裂，溶酶体被破坏，细胞内容物释放到细胞外而引起炎症反应，而在凋亡过程中细胞质膜反折，包裹细胞器或断裂的染色质片断，然后逐渐分离，形成众多的凋亡小体（apoptotic bodies）,凋亡小体则为邻近的细胞所吞噬。整个过程中，细胞质膜的整合性保持良好，死亡细胞的内容物不会泄漏，所以不引起炎症反应和周围组织的损伤。细胞凋亡的机理及其调控是极其复杂的，生物体在长期的进化过程中形成的这种复杂机制对于维持生物体的正常生理功能是极其重要的。

1．物理性因子：包括射线。热激。冷激等，
2．化学及生物因子：包括活性氧基团和分子（超氧自由基、羟自由基H202）、钙离子载体，VK3、细胞毒素等，DNA和蛋白质合成的抑制剂，如环已亚胺正常生理因子的失调，肿病坏殆因子等等。
本实验通过热激诱导悬浮培养的烟草细胞凋亡，再用DAPI染色观察凋亡的特征，使同学们对凋亡有初步的认识。
材料与试剂： 烟草细胞，MS培养基，2.4-D，1 % DAPI

步骤：
1．细胞培养

用烟草子叶为外植体诱导愈伤组织，然后进行悬浮培养，悬浮培养的烟草细胞（MS+2.4-D 0.6mg/L）在27℃、120 振荡培养。

2．热激处理

取对数生长期的烟草悬浮培养细胞，在48℃，120 振荡4小时，然后转到正常培养条件下，（27℃、120 ）恢复培养24小时。

3．细胞核形态的观察

DAPI 是常用的一种DNA结合的荧光染料，细胞经热激处理后用DAPI染色3分钟，在荧光显微镜下观察,可以观察到细胞核的形态变化。

a、 正常的烟草细胞核，核形完整，染色质均匀。

b、 染色质固缩，向外周聚集，形成周边化。

c、 染色质进一步固缩，形成很多颗粒物质。

d、 细胞核破裂形成碎片，核解体。

检测细胞凋亡的方法，除了以上介绍的形态学观察外，还有以下几种方法在科研工作中广为应用。

（1） DNA琼脂糖凝胶电泳：

细胞发生凋亡时，其DNA发生特征性的染色小体间的断裂，产生大小不同的DNA片段，但其长度都是180-200bP的整数倍，将凋亡细胞提取DNA进行琼脂糖凝胶电泳并用溴乙啶进行染色时，这些大小不同的DNA片断呈现出梯状条带。即DNA LADDER。这一特征已成为检测凋亡的最有说服力的标准。

正常的DNA由于无降解，电泳条带表现为一大分子片段。

坏死组织的DNA是随机断裂的，电泳下为从大到小连续分布的弥散条带。

凋亡细胞由于核酸内切酶激活后特异地在染色体上核小体连接区把DNA链切断，使染色体DNA降解成核小体DNA长度的整数倍，故电泳下为阶梯状条带。

该方法缺陷是不能对单个细胞进行分析，亦不能分析细胞中凋亡发生的位置。

（2） TUNEL 检测

细胞发生凋亡时，DNA被内源性的核酸内切酶切开许多断口，TUNEL检测就是通过检测这些断裂来确定凋亡是否发生，这种方法非常灵敏，可以检测到早期的细胞凋亡，而且用这种方法还可以进行单细胞分析，可对凋亡细胞进行原位检测。

这种检测的基本原理为，在脱氧核甘酸未端转移酶的作用下，带有标记的脱氧核甘酸被连接到DNA断裂端的3''-OH上，这种标记可以是荧光生物素，在这种情况下，可以在荧光显微镜下观察结果。

（3） 流式细胞分析技术

在凋亡过程中，由于核酸由内切酶的作用，使凋亡细胞DNA发生断裂，形成DNA碎片，细胞经过破膜和渗透处理后，低分子量的DNA碎片会流出细胞核。

此外，由于凋亡细胞染色质极度固缩，使一部分染色质不能被染料染色。

由于以上两个原因，细胞经渗透处理后，再用PI染色时，在凋亡细胞中可检测到的染色质含量比正常细胞的少，用流式细胞仪可以将细胞按DNA含量不同进行分类，因而可以将凋亡细胞和正常细胞区分开。