血 糖 的测 定
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一、改良的邻甲苯胺硼酸法(O-TB法)
【要 求】
1、了解血糖微量测定的基本原量。
2、掌握血糖正常水平及其测定的临床意义。
3、复习血糖的来源、去路及其调节的有关理论知识。
【原 理】
葡萄糖为一含醛基的已糖，在酸性条件下加热，可脱水生成5－羟甲基－2－呋喃甲醛，者与邻甲苯胺缩合成一绿青色的化合物，其颜色的深浅与样品中葡萄糖的含量正成比，与进行同样处理的标准葡萄糖液相比较可求出样品中葡萄糖的含量。
正常血糖水平为：80～120mg/100ml，在糖尿病及肾上腺皮质机能亢进和脑下垂体机能亢进的患者血中葡萄糖含量可显著升高，饥饿时，血糖水平可下降。
【试 剂】
1、O-TB试剂
2、葡萄糖标准液(1.0毫克/毫升)。
【器 材】
1、硬质中试管三支。
2、刻度吸管：0.1毫升三支；5毫升一支。
【操 作】
取硬质中试管三支，分别标以1、2、3号，按下表操作；混匀后同时将三支试管置于100℃水浴中，加热5～6分钟后，取出用冷水冷却，在30分钟内用721型分光光度计在620mn比色。以空白管调零，分别测得A样和A标。
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试 剂（毫升） |
管 号 | ||
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1（空白管） |
2（样品管） |
3（标准管） | |
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蒸馏水 |
0.1 |
— |
— |
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血 浆 |
— |
0.1 |
— |
|
葡萄糖标准液 |
— |
— |
0.1 |
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O—TB试剂 |
5.0 |
5.0 |
5.0 |
【计 算】
每100毫升血浆中葡萄糖含量(毫克)
＝ ×0.1× = ×100
附注：如血中葡萄糖糖量过高，颜色太深，可于样品管中加倍加入O-TB试剂，加热冷却后比色，并将最后的计算结果乘2，即得每100毫升血浆中葡萄糖的含量。
【试剂配制】
1、O-TB试剂
1.5克硫脲在883.2毫升冰醋酸中溶解后加邻甲苯胺76.8毫升混合，再加饱和硼酸溶液40毫升。充分混匀后放入褐色试剂瓶内贮存备用，一般可贮存几个月。
附：饱和硼酸溶液：称取硼酸6克溶于100毫升蒸馏水中，放置一夜过滤即可应用。
2、葡萄糖标准贮存液 ：每毫升10.0毫克，用0.25％安息香酸溶液配制。
3、葡萄糖标准应用液：每毫升1.0毫克，用0.25％安息香酸溶液将贮存液稀释十倍(3％三氯醋酸可代替安息香酸溶液)。
二、葡萄糖氧化酶法
【原 理】
在pH7.0条件下，葡萄糖氧化酶可催化血样中葡萄糖氧化生成葡萄糖酸及过氧化氢。后者在过氧化物酶的作用下与苯酚，4—氨基安替吡啉氧化缩合成红色醌式物质，在505nm处有最大吸收峰，标本中葡萄糖含量与吸光度成正比，可求得血样中葡萄糖含量。用本法测定葡萄糖具有高度特异性，因此其准确度远比O－TB法为高，更能反映了血中葡萄糖的真实含量，是科研工作中常用的葡萄糖测定方法。随着试剂药盒的推广普及，此法也已广泛应用于临床检测。其反应过程如下：
β—D葡萄糖＋O2＋H2O D—葡萄糖酸＋H2O2
H2O2＋4—氨基安替吡啉＋苯酚 H2O＋红色醌式物质
【操 作】
取硬质中试管三支，分别标以1．2．3号，按下表操作：
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测定管 |
标准管 |
空白管 |
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血清（或血浆） |
0.02ml |
/ |
/ |
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葡萄糖标准液100mg/dl |
/ |
0.02ml |
/ |
|
蒸馏水 |
/ |
/ |
0.02ml |
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酶、酚混合试剂 |
1.5ml |
1.5ml |
1.5ml |
混匀后37℃保温15分钟，使用721型分光光度计在505nm波长下比色，以空白管调零分别测得A样和A标。
【计 算】
葡萄糖含量mg/dl= ×0.02×
【试 剂】
北京化工厂葡萄糖测定试剂盒
试剂组成：1、酚试剂 1瓶 107ml
2、酶试剂 1瓶 107ml
3、葡萄糖标准 2只 2ml（100mg/dl）
试剂有效成份： 葡萄糖氧化酶 3000U/L
过氧化物酶 1000U/L
4－氨基安替吡啉 50mg/L
苯酚 500mg/L
三、吴宪—Folin法
【实验原理】
无蛋白血滤液中的葡萄糖，在碱性溶液中与硫酸铜共热，蓝色的二价铜（Cu++）即还原成砖红色氧化亚铜（Cu+）沉淀，氧化亚铜再使磷钼酸还原成钼蓝，与同样处理的标准葡萄糖液比色，可求出血中葡萄糖的含量。
Na2CO2+H2O===NaOH+NaHCO3
2NaOH+CuSO4====Cu(OH)2+Na2SO4
2Cu2O+C6H12O6→Cu2O↓＋C5H11O5COOH＋2H2O
3Cu2O+H3PO4·2MoO3·12H2O→3H3PO4·Mo2O3·12H2O＋6CuO
【实验操作】
1、无蛋白血滤液的配备：取干试管一支，准确加入蒸馏水3.5ml，血液0.1ml，2/3N H2SO4 0.2ml，10％Na2WO40.2ml，混匀，离心，收集滤液备用。
2、取试管3支，编号，按下表操作：
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编 号 |
标准管 |
测定管 |
空白管 |
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标准葡萄糖液 |
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1.0ml=0.025mg(ml) |
2.0 |
— |
— |
|
无蛋白血滤液（ml） |
— |
2.0 |
— |
|
蒸馏水（ml） |
— |
— |
2.0 |
|
碱性铜试剂（ml） |
2.0 |
2.0 |
2.0 |
充分摇匀，置沸水浴中准确煮沸8分钟，取出切勿摇动，置于冷水浴冷却，然后于各管分别加入磷钼酸试剂2.0ml，混匀，放置3分钟，再于各管加蒸馏水3.0ml并混匀，在620nm波长处以空白管调零，比色，记录各管光密度值。
【计 算】
血糖mg%= 
×0.05×4/2×100/0.1
= ×100
【临床意义】
血糖正常值：80—l20mg，超过120mg％称为高血糖症；超过160mg％可出现糖尿。糖尿病、甲状腺机能亢机、脑垂体前叶机能亢进、肾上腺皮质和髓质机能亢机等，均可出现高血糖和糖尿。血糖低于70mg％称为低血糖症，多见于胰岛素分泌过多，肾上腺皮质机能减退、脑垂体前叶机能减退、甲状腺机能减退等。
【注意事项】
1、本法所测得的血糖并不完全是真正的血糖，因滤液中尚有其它还原性物质的干扰(约占10％)，故结果偏高。
2、血糖测定应在取血后2小时内完成，放置过久糖易分解，致使结果偏低。
3、磷钼酸试剂应贮于棕色瓶中，如出现蓝色，表明试剂本身已被还原，不能再用。
4、碱性铜试剂中有氧化亚铜沉淀，也不能用。取碱性铜试剂lml，加磷钼酸试剂1ml，如蓝色消失，表明此试剂无氧化亚铜，可用。
【试 剂】
1、碱性铜试剂：称取无水Na2CO340g，溶于100ml蒸馏水中,溶后加酒石酸7.5g若不易溶解可稍加热，冷却后移入1000ml的容量瓶中。另取纯结晶CuSO4 4.5g溶200ml蒸馏水中，溶后再将此溶液倾入上述容量瓶内，加蒸馏水至1000ml刻度，放置备用。
2、磷钼酸试剂：取纯钼酸70g，溶于10％NaOH400ml中，其中再加Na2WO410g，加蒸馏水至总体积约为800ml，加热煮沸30—40分钟，以除去钼酸中可能存在的NH3，冷却后加85％H3PO4 25ml，加蒸馏水稀释至1000ml刻度，摇匀，贮棕色瓶保存。
3、标准葡萄糖液：
贮存液（1.0ml＝10mg葡萄糖）：准确称取纯葡萄糖1.0g用0.25％苯甲酸液溶解，倾入100ml的容量瓶中，最后加0.25％苯甲液至刻度，摇匀，放置冰箱中保存。
3、标准葡萄糖液：
贮存液（1.0ml＝10mg葡萄糖）：准确称取纯葡萄糖1.0g用0.25%苯甲酸液溶解，倾入100ml的容量瓶中，最后加0.25％苯甲酸液至刻度，摇匀，放置冰箱中保存。
应用液（1.0ml=0.025mg葡萄糖）：准确取上述贮存液0.5ml移入200m容量瓶中，加0.25％苯甲酸溶液至刻度。
4、0.25％苯甲酸液：称取苯甲酸2.5g，加入煮沸的蒸馏水1000ml中，使成饱和溶液，冷却后，取上清液备用。
5、10％Na2WO4
6、2/3NH2SO4
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